杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我国特有的胶源树种和药用树种，含有杜仲橡胶、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、不饱和脂肪酸、木质素类等多种天然产物，被广泛应用于橡胶、航天、军工、化工、医疗以及医药、保健、食品等多个领域。提高重要天然成分含量是当前杜仲育种的技术难点，其合成与高效积累的分子机理是杜仲分子育种和定向培育的重要组成部分。摸清杜仲重要成分合成关键酶基因的多样性、表达调控机制及次生代谢物积累的分子机理，可为分子调控和分子育种提供重要理论基础。

全文以杜仲国审良种“华仲6号”果实和叶片为实验材料，完成了幼叶、成熟叶、幼果、成熟果实转录组数据组装及重要基因功能注释；揭示出果实和叶片主要活性成分和营养成分合成途径中基因的表达差异；克隆出α-亚麻酸、苯丙素类、黄酮类、杜仲橡胶合成途径系列基因全长cDNA，并揭示出果实和叶片杜仲橡胶积累机理；对萜类生物合成MEP途径系列基因以及杜仲橡胶合成关键酶基因进行了亚细胞定位；初步建立了杜仲遗传转化体系，以“华仲6号”杜仲良种叶片为外植体，愈伤组织诱导率达70%，月增殖系数达到253%，丛生芽诱导率达到50%，诱导生根率达到80%；构建出含TIDS杜仲橡胶合成关键基因的pGEX-4T-1植物表达载体，正在开展转基因研究。

一 建立了不同时期杜仲果实、叶片转录组数据库

对不同时期的杜仲叶片和果实进行转录组测序、组装和功能注释，获得了大量基因的表达特性和序列信息，为杜仲分子水平研究奠定了良好基础。对国审杜仲良种“华仲6号”果实和叶片进行转录组测序和生物信息学分析，共获得了106264108个reads、9563769720个 Nucleotides （nt）、1316317个Contig、292591个Scaffold、185403个Unigene片段；对All-Unigene功能注释分别获得了67119个、67119个和4948个CDS、蛋白和EST的Unigene；GO、COG、KEGG分类分别注释出72893、42359、43715个Unigene。

表1 不同时期杜仲叶片和果实转录组测序、组装和功能注释

二 杜仲橡胶等萜类物质合成途径重要基因的表达差异和基因克隆

杜仲萜类物质如环烯醚萜类和多萜——杜仲橡胶被医药和工业行业高度重视。环烯醚萜类已被证明具有抗癌、抗衰老、降血压、降血脂、增强免疫功能等多种药理作用，备受国内外医药界关注；杜仲橡胶具有独特的“橡胶—塑料二重性”，在低温可塑性、热弹性、共混性、高绝缘性和耐腐蚀性等方面远远优于三叶橡胶，可广泛应用于橡胶工业、航空航天、军工、船舶、化工、医疗等多个领域。然而，杜仲萜类物质合成与高效积累的分子机理尚不清楚。所有萜类物质均通过甲羟戊酸（MVA）和2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径合成（图1），深入研究两个途径关键酶与相关酶的基因全长、表达差异、遗传多样性，将为杜仲橡胶等萜类物质合成分子机理与分子改良提供重要理论依据。

图1 萜类生物合成MEP途径与MVA途径示意图

1.萜类生物合成MVA途径相关基因的表达差异和全长cDNA特征

在杜仲果实和叶片转录组测序数据基础上，分离克隆出MVA途径系列基因，并利用生物信息学方法对杜仲果实和叶片MVA途径基因的表达差异、序列特征及结构特点进行详细分析和预测，为解析杜仲MVA途径分子机理、高效积累的遗传机理以及分子育种研究提供了理论基础。

杜仲幼果和成熟果转录组中，萜类合成MVA途径共涉及30个Unigene，包括7个ACOT基因、3个HMGS基因、11个HMGR基因、2个MK基因、2个PMK基因和5个MDP基因。表达差异分析表明，EuACOT2～EuACOT6、EuHMGS1～EuHMGS3、EuHMGR1、EuHMGR2、EuHMGR 8、EuHMGR 10、EuMK1、EuMK2、EuPMK1、EuMDP1～EuMDP5在幼果和成熟果实中表达量具有显著差异。EuHMGR4、EuHMGR5在幼果中有特异表达；EuACOT7、EuHMGR10在成熟果实中有特异表达。杜仲幼果和叶片转录组中，萜类物质合成MVA途径共涉及23个Unigene，包括3个ACOT基因、3个HMGS基因、8个HMGR基因、2个MK基因、1个PMK基因以及6个MDP基因。表达差异分析表明，EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4～EuHMGS6、EuHMGR17、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7～EuMDP11在幼果和成熟果实中的表达量具有显著差异。EuHMGR15、EuHMGR17在幼果中是特异表达。

在幼果和成熟果实中鉴定出3个MVA途径系列基因全长cDNA。其中，EuACOT1基因全长cDNA为1248bp，编码416个蛋白质，属于稳定的疏水性蛋白；EuHMGS2基因全长cDNA为1356bp，编码452个蛋白质，属于不稳定的疏水性蛋白；EuHMGR9基因全长cDNA为1770bp，编码590